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                淫羊藿总黄酮胶囊对切除卵巢大鼠发生骨质疏松症的影响

                CSOBMR2021-08-21 10:08:37

                作者:

                葸慧荣1 马慧萍1,2 高玉海1 杨芳芳1 李文苑1 陈克明1

                单位:

                1. 兰州军区总医院骨科研↓究所

                2. 全军高原环境损伤防治重点实验室


                摘要:目的? 探讨淫羊藿总黄酮胶囊(total flavonoids of epimedium capsules,TF)能否预防绝经后骨质疏松症的发生。方法? 5月龄Wistar雌性大鼠48只,采用数字表法随机分为4组:假手术组(Sham-operated,Sham)、切除卵ξ 巢组(ovariectomized,OVX)、炔雌醇组(ethinylestradiol,EE)和淫羊藿总黄酮胶囊组(TF),每组12只。除Sham组外各组行切除卵巢术建立大鼠绝经模型,TF组㊣灌胃剂量为265 mg/(kg?d),EE组灌胃卐剂量为200 μg/(kg?d),OVX和Sham组仅灌服等体积蒸馏水。两个月后处死所有大鼠,对各组》大鼠进行离体骨密度(bone mineral density,BMD)、骨生物力学、血清骨代谢指标检测、Micro-CT扫描以及重要脏器的器官指数计算和病◇理学观察。结果? 实验期间,各组大鼠体质量以及重要器官的器官指数差异无统计学意义(P>0.05),病◢理学观察未见异常变化,但OVX组和TF组的子宫指数低于Sham组,且差异具有统计学意义(P < 0.05)。BMD检测结果:OVX组股骨BMD(0.109 g/cm2)低于Sham组(0.128 g/cm2)、EE组(0.125 g/cm2)、TF组(0.123 g/cm2),且差异具有统计学意义(均P < 0.01),各组间椎骨变化与股骨呈相同趋势。生︼物力学结果显示:OVX组股骨和椎骨最大载荷分别为95.9、201.9 N,且显著低于Sham组,而TF组股骨和椎骨最大载荷╳值分别为122.1、226.6 N,且显著高于OVX组,各组间弹性模量变化与最大载荷变化呈相同趋ξ势。VG染色结果:与Sham组相比,OVX组的骨小梁数目明显减少,分离度增大,与OVX组相比,EE组、TF组骨小梁数目增加,分离度降低。血清骨代谢指标检∩测结果:OVX组骨钙素(osteocalcin,OC)含量为104.6 ng/mL,低于Sham组(154.5 ng/mL)、EE组(151.7 ng/mL)、TF组(136.9 ng/mL),且差异有统计学意义(均P < 0.05);Ⅰ型原胶原N端前肽(propeptide of type Ⅰ procollagen,P1NP)含量变化与OC变化趋♂势一致;OVX组抗酒石酸酸性磷酸-5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b,TRACP 5b)含量为1.57 U/L,显著高于Sham组(0.76 U/L)、EE组(0.38 U/L)和TF组(0.95 U/L),且差异具有统计学意义(均P < 0.05);Ⅰ型胶原C末端肽(type Ⅰ collagen C-terminal peptide,CTX-Ⅰ)含量变化与TRACP 5b变化趋势▅一致。Micro-CT扫描结果:股骨的体积骨密度(bone mineral desity,BMD)、骨小梁数目(trabecular number,Tb.N)、骨小★梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁分⊙离度(trabecular spacing,Tb.Sp)和骨体积/组织体积(bone volume/tissue volume,BV/TV)在各组间的变化趋势与骨组织形态计量学分析结果相一致,股骨皮质骨在各组间均无显著性变化。结论? 淫羊藿总黄酮胶囊可预防切除卵巢大鼠发生骨质疏松症,其可能机制是具有抑制骨吸收和提高骨形成∞的双重活性。

                关键词:淫羊藿总黄酮;骨密度;骨形成;骨吸收;Micro-CT


                随着我国人口结构日趋老龄化,骨〓质疏松症的患病率逐年增加,已日益构成对患者及其家庭的严重威胁,对社会和经济发展也造成了一定程度的影响。中医药防治骨质疏松症具有悠久的历史,其中淫羊藿是最常用的中草药之一。据报道,淫羊藿提取物具有激素样作用→, 可使雄性大鼠的睾酮分泌量增加,使雌性大鼠的卵巢和子宫增重,其注射液能促进鸡胚股骨生∑长。淫羊藿水提物能部分抑制去睾丸大鼠的高骨转换率,淫羊藿总黄酮能预防维甲酸诱导的大鼠骨质疏松症,对糖皮质激素所致大鼠骨质疏松症也有一定的治疗效果。淫羊藿总黄酮对切除卵巢大鼠发生骨〒质疏松的影响已有文献报道,但这些文献大多发表于10多年前,那时尚无精确的骨密度检测方法,不同作者得出的结论←也不一致;而李晶等仅报道淫羊藿总黄酮对去势大鼠的股骨具有保护作用,且其评价方法仅采用了骨生物力学和脱钙骨组织的病理切片。现在淫羊藿总黄酮胶︽囊在我国已上市,用于治疗原发性骨质疏松症。为考察其对绝经后骨质疏松症的疗效,本研究●采用双能X线吸收检测法(dual energy X-ray absorptiometry,DXA)测定骨密度(bone mineral density,BMD)、micro-CT扫描股骨微结构,并收集骨代谢生化指标、骨生物力学和骨组织形态计量分析等指标全面评价淫羊藿总黄酮胶囊对切除卵巢大鼠所致骨质疏松症的影响。


                材料与¤方法

                动物与分组

                5月龄雌性Wistar大鼠48只,体质量(225±10)g,SPF级,购自中国农业科学研究院兰州兽医研究所〓实验动物中心,实验动物合格证号:SCXK(甘)2014-0006-152。适应性饲养1周后采用数字表法随机分为4组,每组12只,分别◣为假手术(Sham-operated,Sham)组、切除卵巢(ovariectomized,OVX)组、炔雌醇(ethinylestradiol,EE)组和淫羊藿总黄酮胶囊(total flavonoids of epimedium capsules,TF)组。除Sham组外,均以标准外科程序切除双侧卵巢,对Sham组行相同外科操作,但仅切除☆等体积脂肪组织。术后连续3 d给予青霉素,1周后开始灌胃给药。EE组的给药剂量为200 μg/(kg?d),TF组由人的口服剂量换算而来,即(350 mg/粒×2粒×3次/d)/50 kg×6.3=265 mg/(kg?d),Sham组和OVX组均给予等体积蒸馏水(1 ml/200 g)。每天早晨9:00-10:00灌胃,每周6 d,每2周称1次体质量,每个月检测1次全身BMD,待组ω间全身BMD出现显著性差异后即处死所有动物,逐项开展以下检测。


                试剂与仪器

                淫羊藿总黄酮胶囊(江苏康缘阳光药业,国药准字Z20140012),炔雌醇(中国食品药品检定研究院,批号:GAJ7-N8RF),Micro-CT(ScanSky 1176,Bruke, 瑞典),DXA(Prodigy,GE,美国),酶标仪(Epoch, BioTek,美国),正置荧光显微镜(奥林巴斯公∞司,日本),万能材料试验机(AG-IS,岛津公司,日本),硬组织切片机(SP1600,LEICA公司,德国),雌二醇、骨钙素和抗酒石酸↘酸性磷酸酶试剂盒(IDS公司,丹麦)。


                检测指标

                子宫系数、病理学分析及雌二醇水平检测:大鼠处死后即刻剥离肝、脾、肺、双侧肾和子宫,剥离附着的软组织后称质量,计算器官指数(器官质量/体质量),然后用10%甲醛溶液固定,常规包埋,切成5 μm石蜡切片,HE染色后进行镜下观察与分析;腹主动脉抽取血※样, 3 500 r/min离心10 min,取上层血清,通过ELISA试剂盒检测血清中雌二醇水平。


                BMD检测:用10%水合氯醛腹腔Ψ 注射麻醉大鼠,用DXA检测全身BMD,当发现组间差异有统计学意义后处死所有动物,分离椎骨和右侧股骨,分别置检查床上检测其BMD值。


                生物力↑学试验:椎骨和右侧股骨用浸透了0.9%氯化钠注射液的医用纱布包裹后置-80 ℃冻存,临用▅前自然解冻。股骨置于AG-IS型万能试验机上进行三点弯曲测试,跨距14 mm,加载速度10 mm/min,计算机记录∞载荷变形曲线及最大载荷、弹性模量等。取大鼠第4腰椎骨(L4)用于压缩试验,将椎体两面的椎间盘及软组织切除,用砂纸将椎骨打磨成上下两个面平行的圆柱体,将圆柱」体垂直放置于不锈钢平台上,逐渐加载压力,加载速度为2 mm/min,记录载荷变形曲线,获得▅最大载荷、弹性模量等。


                骨形态计量学分析:采用∑ 不脱钙骨组织切片法进行骨形态计量学分析。新鲜分离的左侧胫骨用4%多聚甲醛固ζ 定后,梯度█浓度乙醇脱水,过渡至二甲苯中,随后浸入以甲基丙烯酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯和过氧化苯甲酰按不同比例配成的1号、2号、3号液中各7 d,最后用4号液包埋。将包埋好的骨组织用LEICA SP1600锯式切片机切成约50 μm的骨片,用502胶水将骨片封固于载△玻片上,用1 200~2 000目砂纸打磨至显微镜下可见的厚度,然后进行Van Gilson染色(VG染色),具体步骤为:将打磨好的○切片超声润洗10 min,0.1%甲酸浸泡3 min,2%甲醇浸泡2 h,流水冲洗3 min,亚甲基蓝60 ℃水浴5~8 min,水洗致不褪色,苦味酸品红染色15 min,无水乙醇冲洗数秒,二甲苯透明1~2 min,即完成染①色,镜下观察骨组织形态并进行量化分析, 量化分析指标包括定量分析包括骨小梁数目(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular spacing,Tb.Sp)。


                血清骨代谢生化指标检测:大鼠麻醉后自腹主动脉抽取血样,静置30 min,3 500 r/min离心10 min,取上层血清冻存于-80℃。骨形成指标检测骨钙素(osteocalcin,OC)、Ⅰ型原胶原N端前肽(propeptide of type 1 procollagen,P1NP),骨吸收指标抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b,TRACP 5b)、Ⅰ型胶原C末端肽(type 1 collagen C-terminal peptide,CTX-1)均采用丹麦IDS公司生产◣的试剂盒∏,分别为Rat-MIDTM Osteocalcin EIA kit、Rat PINP EIA kit和RatTRAPTM(TRACP 5b)、RatLapsTM(CTX) EIA kit。按说明书制作各自标准曲线,从标准曲线计算出样品中OC和、P1NP、CTX-1、TRACP 5b的含量,单¤位分别为μg/mL、μg/mL和μg/mL、U/L。


                Micro-CT扫描:从每组新鲜剥离的左侧股骨中采用数字表法随机取6根,用70%乙醇固定后置4℃冰箱保存。Micro-CT扫描的条件是:电压70 kV,电流114μA,单∴层扫描时间24.8 min,间隔时间200 ms,分辨率为中度(medium)。对同一样品扫描获得500张不同截面的▆1 024×1 024像素图片,分别以骨骺线下100~200层和300~400层分析松质骨和皮质骨感兴趣区(regions of interest,ROI),用Dataviewer软件进行数据重建,用CTAn软件进行参数定量分析,包括体积BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BV/TV等,并制作3D模型,最后用Mimics17.0软件对3D模型进行图像处理。


                统计学方法

                实验数据均采╲用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS17.0软件进行单因素方▲差分析√(one-way ANOVA),若方差齐性,则组间采用LSD检验;若方差不齐则采用welch校正后做方差分析,组间采用Dunnett's T多重检验。以P<0.05为差异有统计学意义。


                结果

                淫羊藿总黄酮胶囊对大鼠BMD的影响

                全身BMD检测结果※显示,1个月后首次进行全身BMD检测,未发现各组间差异有统计学意义(P<0.05);两个月后,与Sham组相比,OVX组大№鼠全身BMD值显著降低(P<0.01);与OVX组相比,EE组、TF组全身BMD均升高,且差异有统计学意义(P<0.05)(表 1);大鼠处死后立即剥离椎骨和右侧股骨并检测BMD,结果呈现与上述相同的趋势(表2)。


                淫羊藿总黄酮胶囊对大鼠股骨、椎骨力学性能的影响

                生物力学试验结果表明,与Sham组相比,OVX组大卐鼠股骨、椎骨的最大载荷均下降(P<0.01);与OVX组相比,EE、TF组股骨、椎骨的最大载荷升高(P<0.05,P<0.05),各组弹性模※量值差异无统计学意义(P>0.05)(表3、4)。


                淫羊藿总黄酮胶囊对大鼠骨形态计量学的影响

                不脱钙骨组织切片法进行骨形态计量学分析结果显示,与Sham组相比,OVX组中骨小〗梁数目明显减少,骨小梁分离度增加;与OVX组相比,EE组和TF组的骨小梁数目显著赠加,骨小梁分离度明显减↑低,连续性好(图1)。各项量化指标体现出相同趋势(表5)。


                淫羊藿总黄酮胶囊对大鼠骨代谢指标的影响

                血清骨代谢生化指标检测结果表明,与Sham组相比,OVX组血清中OC和P1NP含量降低(P<0.05),TRACP 5b和CTX-1含量增加(P<0.05,P<0.01);与OVX组相比,EE组、TF组OC,P1NP含量均显著增加,TRACP5b,CTX-1含量均显著下降(图2)。


                Micro-CT扫描结果

                由Micro-CT扫描可获得感兴趣区的体积BMD(g/cm3),结果显示OVX组松质骨的体积BMD极显著卐低于Sham组,EE组与Sham组基本处于同一水平,TF组则高于OVX组(P<0.01),股骨皮质骨的体积BMD在各组间差异无统计学意义(表6)。


                而股骨Micro-CT扫描的3D重建效果图显示,Sham组大鼠的骨小梁结构紧密、数目较多,分离度小,连续性好;与Sham组相比,OVX组的骨小梁明显变稀疏,数目变少,出现较大的间隙;与OVX组相比,EE组和TF组骨小梁数目明显增◎多,分离度变小,骨小梁结构变紧密,连续性◤较好。股骨松质骨微结构的各项量化指标结果与CT扫描结果一致,与Sham组相比,OVX组松质骨的BMD、Tb.N、Tb.Th、BV/TV值均下降,Tb.Sp升高,且差异有统计学意义,与OVX组相比,EE组和TF组中BMD、Tb.N、Tb.Th、BV/TV值均增加,Tb.Sp下降,差异均有统计学意义(表7)。大鼠股骨皮质骨3D重建⊙图结果显示,各组皮质骨的厚度和连续性无〗明显差别(图3)。


                淫羊藿总黄酮胶囊对大鼠体质量、子宫系数和病理学分析、雌激素水平□的影响

                所有大鼠体质量均随实验时间的延长而增加,OVX组在各时间点均略高于其他组,但差异无统计学意义(P>0.05);EE组的体质◤量最低,但差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。各组大鼠的心、肝、脾、肺、肾在外观上无明显异常,器官指数在各组间差异无统计学意义(P>0.05),病理学观察未见异常改变。但各组大鼠的子宫出现明显不同的变化,OVX组和TF组与Sham组相比,明显萎缩,器官指数极显】著低于Sham组,EE组的情况则与Sham组相似近。病理学观察结果显示,OVX组大鼠子宫内膜变薄,腺体稀少,表面为一层小而圆的单层上【皮细胞;而Sham组的子宫内膜明显较厚,腺体多且腺腔较大,表面为一层高而密的假柱状上皮;EE组与Sham组相似;TF组虽与OVX组相似,但内膜中腺体比OVX组丰富,上皮细胞高度和密度介于Sham组和OVX组之间(图5)。



                雌二醇检测,可见与Sham组相比,OVX组的雌二醇水平极显著降低(P<0.01);与OVX组相比,EE组ㄨ显著增高(P<0.05),TF组虽然高于OVX组,但差异无统计学意义(P>0.05)(图6)。


                讨论

                自1948年Albright提出雌激素缺乏是导致绝经后骨质疏松症的主要原因后,雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy,ERT)曾经盛极一时,但随着应用病例的增多,ERT的不良反应逐渐←暴露。美国国立卫生研究院于2002年提前终止的妇女健康倡议(Women's Health Initiative,WHI)研究项目显〇示,ERT的风险和危害远大于其益处,可使乳腺癌、卒中和心脏病的发病率分别提高26%、40%和29%。从那时起,人们一直试图寻找新的更安全的疗法,其中以金雀异黄酮和大豆苷元为代表的植物雌激素至今仍是研究热点。淫羊藿因具有“补肾壮阳,强筋健骨”之功效而吸引国内外学者●对其活性成分做了大量研究,现已明确其抗骨质疏松的主要有效成分是以淫羊藿苷为代表的黄酮类化合物,其作用机制是促进骨髓间充质干细胞的成骨性分化,并具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重活性,本课题组曾报¤道淫羊藿苷促进成骨细胞矿化成熟的活性高于金雀异黄酮。但总体而言,淫☆羊藿苷的抗骨♀质疏松活性较温和,难以单ξ独成药,这可能与其作用靶点单一有关。而淫羊藿总黄酮除淫羊藿苷外,还含▼有朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷-Ⅰ等,它们合起来的活性基团更多,作用靶点也更为丰富,因而应具有较单体化合物更强的抗骨质疏松活性。


                本实验中大鼠被切除卵巢两个月后全身及椎骨和股骨的BMD已ㄨ显著低于假手术组,生物力学性能明显下降,松质骨微结构退化明显,表现在骨小梁数目和厚度显著减少,分离度却明显增加。Micro-CT扫描分析结果揭示了相同现象◥,表明本研究已成功建立切除卵巢法诱导的绝经后骨质疏松模型,而血『清骨代谢生化指标的检测结果显示,模型组中骨钙素和P1NP水平明显下降,抗酒石酸酸性磷酸酶和CTX-1活性显著升◥高,表明造成骨质疏松的原因是切除卵巢导致骨形成活性下降而骨吸收活性增加。EE作为阳性对照药抑制了切除卵巢引起的骨质∮疏松,并保持了子宫的正常形态与功能。淫羊藿总黄酮同样发挥了抑制切除卵巢◇大鼠发生骨质疏松的作用,并且其BMD、骨生物力学和骨组织形♂态学等多项指标达到了与炔雌醇组十分接近的水平。从药物安全性方面考虑,淫羊藿总黄酮胶囊未对实验大鼠的饮食、体质量等㊣造成明显影响,对切除卵巢所致的大鼠子宫萎缩及降低的子宫系数也无明显改善,提示淫羊藿总黄酮胶囊》可能不具有雌激素样活性,其对骨质疏松症的预防作用可能是通过其他∩途径实现的,这一点与Xiao等的研究结果相一致。


                本实验中淫羊藿总黄酮组与炔雌醇组最大的不同之处在于对子宫和血清雌二醇浓度的影响。炔雌醇显著←提高了切除卵巢大鼠的雌二醇浓度,并使子宫内膜形态及功能达到与假手术组形同的水平,说明炔雌醇可以弥补天然雌激素的不足,对子宫发挥着保护作用,但这也正是雌激素类药物具有潜在致癌性的原因⊙。本实验中淫羊藿总黄酮组的子宫指数、子宫内膜厚度及形态结构,以及血清雌二醇浓度等均与OVX组接近,但在骨代谢╱指标方面又与炔雌醇组的水平相一致,说明淫羊藿总黄酮既具有预防绝经后骨质疏松的作用▽,同时又不会引发生殖系统肿瘤的潜在的不良反应。


                虽然此前已有多篇文献报道了淫羊藿总黄酮对切除卵巢大鼠发生骨质疏松影响,但由于检测BMD的方法不够精确,或只侧重于对某一部︻位骨组织的影响而无法得到全面和一致的结论。本实验从BMD、骨生物力学、骨微结构和骨代谢生化指标等全面分析了淫羊藿总黄酮胶囊对切除卵巢大鼠的☆椎骨、股骨和胫骨的影响,发现相当于人口服剂量的淫羊藿总黄酮可以□ 有效预防这些部位发生骨质疏松,并且对主要脏器及子宫内膜无不良反应,因而可以安全地在临床上推广应用。

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